Основание

Известно, что при беременности у женщин СОЭ существенно возрастает, что указывает на повышение агрегационной способности эритроцитов; при этом значения СОЭ увеличиваются со сроком беременности. Для значений СОЭ беременных женщин характерна высокая вариабельность. Например, по нашим данным, индивидуальные значения СОЭ гепаринизированной венозной крови (мм/час) у женщин при неосложненном течении беременности в I триместре варьируют от 6 до 70, а в среднем (M ± m) составляют 26,6 ± 2,5; во II триместре они варьируют от 15 до 68, а в среднем 40,4 ± 2,4; в III триместре они варьируют от 20 до 71, при среднем значении 51 ± 2,6; у рожениц — от 23 до 75, при среднем значении 50,8 ± 3,5 (рис. ниже).

Природа повышения СОЭ до настоящего времени неясна, хотя высказаны различные предположения, что рост СОЭ обусловлен изменением состава плазмы крови, например, фибриногена, С-реактивного белка и других ее компонентов, а также представление о фазности процессов, происходящих в течении 60-минутного наблюдения за СОЭ. Мы предполагаем, что повышение СОЭ при беременности у женщин является следствием активации Са-активируемых калиевых каналов промежуточной (или средней) проводимости, т.е. Гардош-каналов, в результате чего повышается выход ионов калия из эритроцитов, что меняет мембранный потенциал эритроцита и его поверхностный заряд (дзета-потенциал); все это и повышает агрегационную способность эритроцитов, а тем самым — и СОЭ. Эта гипотеза базируется на данных литературы, согласно которым в эритроцитах человека наряду с Са-каналами L-типа и Са-насосом плазматической мембраны, натрий-калиевым насосом, неселективным потенциалзависимым катионным каналом и другими ионными каналами имеются Са-активируемые калиевые каналы средней, или промежуточной, проводимости (IK-каналы, или SK4). По имени автора, впервые указавшего на их существование, они называются Гардош- каналами. Показано, что увеличении концентрации ионов Са2+ в цитозоле эритроцита повышает активность Гардош-каналов, в результате чего ионы К+ по градиенту концентрации покидают эритроцит, а вместе с ними выходят ионы Clи вода. Это снижает содержание воды в эритроцитах, уменьшает его объем, повышает его осмотическую устойчивость к гипотонической среде и к действию гемолитических факторов, ускоряет фагоцитоз старых или поврежденных эритроцитов макрофагами [24], что, в целом, препятствует выходу гемоглобина в плазму. Кроме того, выход ионов К+ из эритроцитов по Гардаш-каналам вызывает гиперполяризацию эритроцитов, что меняет дзета-потенциал и тем самым повышает агрегационную способность эритроцитов, что, вероятно, отражается в увеличении значений СОЭ. Косвенно о повышении при беременности активности Гардош-каналов указывают данные литературы, согласно которым у женщин при беременности возрастает осмотическая устойчивость эритроцитов к гипотонической среде, снижается гематокритное число и число эритроцитов в расчете на единицу объема крови, т.е. развивается гемоделюция и «физиологическая анемия». Так, по данным Долгушиной Н.А., гематокритное число при беременности снижается с 38 % до 34 %, а число эритроцитов (1012 в 1 л) — с 4,5 до 3,8.

Основная цель данной работы состояла в доказательстве рабочей гипотезы, согласно которой рост СОЭ при беременности у женщин обусловлен повышением активности Гардош-каналов. Для этого предполагалось оценить изменение СОЭ гепаринизированной венозной крови беременных женщин под влиянием искусственного снижения активности Гардош-каналов. Согласно данным литературы, снизить активность Гардош-каналов можно путем уменьшения содержания свободных ионов Са2+ в плазме, например, связывая их цитратом натрия или ЭДТА, либо ингибируя вход ионов Са2+ в эритроцит, используя для этих целей блокатор Са-каналов L-типа, например, верапамил, а также за счет прямого ингибирования Гардошканалов с помощью классического ингибитора этих каналов клотримазола или путем повышения в среде ионов калия до 25 мМ и выше, например, используя гиперкалиевый раствор Кребса.

В рамках предлагаемой гипотезы важным является также вопрос о факторах, которые повышают активность Гардош-каналов у беременных женщин и обуславливают у них высокую вариативность СОЭ. Наиболее логично допустить, что такими факторами являются гормоны беременности, в том числе эстрогены и прогестерон, уровень которых, как известно, у женщин прогрессивно возрастает при беременности. Для проверки этого предположения мы считали возможным оценить изменение при беременности СОЭ гепаринизированной крови крыс, у которых при беременности, как и у человека, возрастает содержание в крови прогестерона и эстрогенов, хотя накануне родов уровень прогестерона снижается, что расценивается как один из механизмов индукции родов.

С учетом всего сказанного в работе были поставлены две задачи:

• Оценить изменение СОЭ гепаринизированной венозной крови женщин с неосложненным течением беременности под влиянием цитрата натрия (5х10–2 г/ мл, или 290 мМ), блокатора Са-каналов L-типа верапамила (10–10–10–5 г/мл или 2х10–10–2х10–5 М), блокатора Гардош-каналов клотримазола (10-10-10-4 г/мл или 2,9х10–10–2, 9х10–4 М) и блокатора Гардош-каналов гиперкалиевого раствора Кребса (10, 20, 30, 40, 50 и 60 мМ КСl). Эта задача решалась в сериях 1–4.
• Исследовать СОЭ гепаринизированной крови небеременных и беременных наркотизированных крыс и влияние на нее ряда БАВ, в том числе окситоцина (10–7–10–3 МЕ/мл), ацетилхолина (10–6 г/мл или 5,5х10–6 М), адреналина (10–6 г/мл или 5,5х10–6 М), дидрогестерона (10–6 г/мл или 3,2х10–6 М). Это исследование проведено в серии 5.

Материал и методы исследования

В первых четырех сериях исследовали гепаринизированную венозную кровь, полученную в условиях женской консультации у 13 женщин на 7–37 неделях неосложненной беременности с личного согласия исследуемых (до 6 мл), используя вакуумные пробирки для забора венозной крови с Na-гепарином (фирма Improve). В серии 5 исследовали гепаринизированную кровь 10 небеременных крыс, взятых в опыт в фазе метаэструса, которую определяли по картине влагалищного мазка, а также кровь 4 беременных крыс, взятых в опыт на 5, 7, 7 и 21 дни беременности, которые определяли по размерам продуктов зачатия. Забор крови у крыс проводили с учетом «Правил лабораторной практики в РФ» (приказ МЗ РФ от 2003 г., No 267) путем пункции сердца в условиях эфирного наркоза, используя вакуумные пробирки с Na-гепарином. Во всех пяти сериях кровь исследовали спустя 3–4 часа после ее забора (при хранении при 4 °С).

Определение СОЭ проводили по методу Панченкова в нашей модификации, т.е. без использования цитрата натрия. Для этого на предметное стекло с помощью микродозаторов «Ленпипет» наносили 200 мкл крови и к этому объему добавляли в объеме 20 мкл раствор Кребса или раствор Кребса, содержащий исследуемое вещество в одной из концентраций, указанных выше (т.е. соотношение составляло 10:1). После перемешивания смесь набирали в капилляр Панченкова до метки «0», устанавливали в штатив в вертикальном положении и через 60 минут оценивали СОЭ.

В работе использовали таблетированный верапамил (АО «Алкалоид», Македония), таблетированный клотримазол (ООО «Озон», Жигулевск), ампулированный окситоцин (ОАО «Синтез», Курган; ОАО «Гедеон Рихтер», Венгрия), ампулированный адреналина гидрохлорид (ФГУП «Московский эндокринный завод»), ацетилхолина хлорид (Acros ORGANICS, Бельгия) и водорастворимый аналог прогестерона таблетированный дидрогестерон «Дюфастон» (Abbott, Нидерланды). Раствор Кребса содержал (мМ): NaСl — 136; KCl — 4,7; CaCl2 — 2,52; MgCl2 — 1,2; KH2PO4 — 0,6; NaHCO3 — 4,7; глюкоза — 11 (pH = 7,4). Результаты исследования оценивали методом непараметрической статистики. Различия с контролем оценивали по критерию Уилкоксона для зависимых выборок, а различия между независимыми показателями — по критерию Манна-Уитни. Во всех случаях их считали значимыми при р < 0,05. В тексте результаты представлены в виде медианы, 25 и 75 центилей.

Результаты исследования и их обсуждение

Серии 1–4 показали (табл.), что фоновые значения СОЭ (мм/час) у 13 беременных женщин варьировали от 6 до 42, а в целом медиана СОЭ составила 40. Эти значения соответствует ранее полученным данным.

В серии 1 показано (таблица), что цитрат натрия статистически значимо (р < 0,05) снижает СОЭ до 77 % от фонового уровня. Это согласуется с данными литературы о том, что уменьшение концентрации свободных ионов Са2+ в среде снижает активность Гардош-каналов [17, 29] и уменьшает агрегационную способность эритроцитов [29]. Эти данные подтверждают нашу гипотезу о том, что повышение СОЭ у женщин при беременности является результатом роста активности Гардош-каналов. Результаты серии 1 представляют интерес и с клинической точки зрения. Как известно, в клинике значения СОЭ даются для цитратной крови. Наши данные показывают, что эти значения примерно на 25 % ниже, чем значения, получаемые для СОЭ гепаринизированной венозной крови.

В серии 2 показано (таблица), что верапамил снижает СОЭ. Статистически значимо это выявлено для концентрации 10–8 г/мл — на ее фоне СОЭ составила 57 % от исходного уровня. Несмотря на то, что в нашем исследовании не получена четкая зависимость эффекта верапамила от его концентрации (в силу большой вариабельности значений СОЭ и относительно небольшого числа наблюдений), мы можем утверждать, что полученный нами в серии 2 результат согласуется с данными литературы, согласно которым уменьшение входа ионов Са2+ в эритроцит путем блокады Са-каналов L-типа снижает активность Гардошканалов, что проявляется в уменьшении способности эритроцитов к агрегации. Тем самым, результаты серии 2 также подтверждают нашу гипотезу. В клиническом плане результат серии 2 позволяет считать, что при терапии угрозы преждевременных родов (УПР) с использованием блокаторов Са-каналов, например, широко применяемого с этой целью нифедипина, СОЭ должна снижаться. Следовательно, по динамике СОЭ гепаринизированной венозной крови женщин, получающих блокатор Са-каналов, можно быстро оценить — создается ли необходимая для терапии УПР концентрация препарата, т.е. достаточна ли она для торможения сократительной деятельности матки.

В серии 3 показано (таблица), что клотримазол снижает СОЭ. Статистически значимо (р < 0,05) это установлено для таких его концентраций как 10–10, 10–9, 10–7, 10–6 и 10–5 г/мл — на их фоне СОЭ составила соответственно 51 %, 87 %, 86 %, 86 % и 62 % от исходного уровня. Хотя, как и в серии 2, мы не получили четкой зависимости эффекта клотримазола от его концентрации в среде (по причинам, указанным выше), а также, учитывая, что клотримазол является блокатором Гардош-каналов [8, 10, 13, 14, 16, 21, 24], результаты серии 3 позволяют утверждать, что блокада Гардош-каналов снижает способность эритроцитов к агрегации и тем самым снижает СОЭ. Это подтверждает нашу гипотезу о том, что повышение СОЭ при беременности обусловлено ростом активности Гардош-каналов.

В серии 4 показано (таблица), что блокада Гардошканалов с помощью гиперкалиевого раствора Кребса также сопровождается снижением СОЭ. Статистически значимо это наблюдалось при воздействии 30, 40, 50 и 60 мМ KCl — на этом фоне СОЭ составила соответственно 66 %, 71 %, 63 % и 51 % от исходного уровня. Так как повышение концентрации ионов К+ в среде блокирует Гардош-каналы, результаты серии 4 также подтверждают нашу гипотезу о том, что повышение СОЭ при беременности обусловлено ростом активности Гардош-каналов.

Полагая, что состояние Гардош-каналов эритроцитов может косвенно отражать и состояние Са-регулируемых калиевых каналов миометрия, о наличии которых более детально сообщается ниже, выскажем предположение, основанное на результатах серий 3 и 4, что оценка влияния на СОЭ венозной крови беременных женщин клотримазола (например, при его использовании в концентрации 10–6 г/мл) или гиперкалиевого раствора (например, 60 мМ KCl) может быть полезной для определения степени активности Са- активируемых калиевых каналов миометрия.

В серии 5 показано (рис. ниже), что у 10 небеременных крыс, находящихся в фазе метаэструса, фоновая СОЭ составила 2 (1;3) мм/час. Эти данные согласуются с результатами исследования Pande S. et al, согласно которым у крыс-самцов СОЭ составляет 1–2 мм/час, и она возрастает до 2–3 мм под влиянием пестицидов, что авторы рассматривают как следствие развития воспаления. Нами показано, что окситоцин (10–7–10–3 МЕ/мл), ацетилхолин (10–6 г/ мл) и адреналин (10–6 г/мл) не влияли на СОЭ небеременных крыс — изменения не превышали 1 мм/час и были статистически незначимы (р > 0,05, по критерию Уилкоксона). Установлено (рис. 1 панель Б) что у крыс, взятых в опыт на 5, 7, 7 и 21 дни беременности (ее продолжительность у крыс составляет 21–22 дня), фоновая СОЭ составила 1 (1;1,5) мм/час. Различие с небеременными крысами оказалось статистически значимым (р < 0,05) по критерию Манна-Уитни. Это свидетельствует о том, что при беременности СОЭ у крыс, в отличие от человека, не возрастает, а даже снижается. Установлено, что дидрогестерон (10–6 г/мл) не изменяет СОЭ беременных крыс (р > 0,05). Таким образом, нами впервые показано, что у крыс, несмотря на повышение уровня в крови прогестерона и эстрогенов, СОЭ эритроцитов не возрастает, а водорастворимый аналог прогестерона дидрогестерон не вызывает у них повышение СОЭ. Нами ранее было показано, что и у женщин СОЭ не возрастает существенно под влиянием высоких концентраций эстрадиола валерата (10–6 г/мл), который является водорастворимым аналогом эстрогенов, и не увеличивается под влиянием высоких концентраций дидрогестерона (10–6 г/мл). Более того, у отдельных женщин дидрогестерон в условиях in vitro снижает СОЭ . Все это означает, что ни эстрогены, ни прогестерон сами по себе не активируют Гардош-каналы и по этой причине не имеют прямого отношения к росту СОЭ при беременности. Поэтому мы не исключаем, что рост активности Гардош-каналов у женщин при беременности обусловлен появлением (под влиянием прогестерона) в крови так называемого эндогенного ингибитора сократимости миоцитов матки (ЭИСМ). Его наличие выявлено в наших исследованиях, о чем детально изложено в обзорной работе. Представление о таком факторе было сформулировано на основе наших данных, согласно которым сыворотка крови мужчин и небеременных женщин (в разведениях 1:50, 1:100 и 1:500) в опытах с продольными полосками рога матки небеременных крыс проявляет выраженный утеростимулирующий эффект, в то время как сыворотка крови беременных женщин, наоборот, ингибирует сократительную активность (СА) миометрия крысы. Это явление мы объясняли появлением в крови ЭИСМ, который, вероятно, повышает активность калиевых каналов миометрия и тем самым препятствует повышению спонтанной и вызванной СА миоцитов матки. Причастность калиевых каналов к действию ЭИСМ доказывает тот факт, что эффект ЭИСМ не выявляется в опытах с миометрием крысы на фоне калиевой контрактуры, т.е. в условиях искусственного блокирования калиевых каналов гиперкалиевым (60 мМ KCl) раствором Кребса. В настоящее время доказано наличие различных калиевых каналов в миометрии человека и животных, среди которых имеются Са-зависимые калиевые каналы большой проводимости, или ВК-каналы, каналы малой проводимости, или SK-каналы , т.е. по природе близкие к Гардош-каналам эритроцитов, и благодаря которым, вероятно, возбудимость миометрия при беременности снижается, что уменьшает степень автоматии и реакцию миометрия на БАВ-утеростимуляторы. В свете изучения природы повышения СОЭ при беременности у женщин и отсутствие повышения СОЭ у беременных крыс, важно отметить, что согласно нашим данным, сыворотка крови беременных крыс в разведениях 1:50, 1:100 и 1:500, как и сыворотка крови небеременных крыс, не ингибирует ССА миометрия, а наоборот, повышает эту активность. Это означает, что у крыс, вероятнее всего, во время беременности не продуцируется ЭИСМ, в связи с чем не происходит активации Гардош-каналов и СОЭ не возрастает.

Таким образом, результаты серии 5 позволяют заключить (рисунок ниже), что рост СОЭ при беременности у женщин является следствием повышения активности Гардош-каналов, которое происходит за счет появления (под влиянием прогестерона) ЭИСМ. Этот фактор можно рассматривать как эндогенный активатор калиевых каналов, благодаря которому (наряду с бета-адренорецепторным ингибирующим механизмом) происходит торможение сократительной деятельности матки при беременности. С этих позиций повышение СОЭ можно расценивать как показатель наличия в крови ЭИСМ, который, в свою очередь, отражает способность прогестерона вызывать у беременных женщин экспрессию гена ЭИСМ, если предположить, что по своей природе ЭИСМ — это пептид или белок. С этих же позиций объясняется высокая вариативность значений СОЭ, характерная для беременных женщин, так как она демонстрирует интенсивность продукции ЭИСМ и его вклад в миометрий-ингибирующий механизм. Такое объяснение коррелирует и с представлением о том, что число Гардош-каналов (в расчете на один эритроцит) широко варьирует: от 1–3 до 300. Это указывает на возможность широкой вариативности значений СОЭ. Поэтому исследование изменения фоновой СОЭ под влиянием блокаторов Гардош-каналов может позволить выявить причину отклонений СОЭ от условной нормы, характерной для данного срока гестации, в том числе оценить вклад Гардош-каналов в эту аномалию.

Заключение

Результаты наших исследований подтверждают гипотезу о том, что повышение СОЭ при беременности у женщин обусловлено ростом активности Гардошканалов, в связи с чем величина СОЭ косвенно отражает состояние Са-зависимых калиевых каналов миометрия, наличие которых установлено для женщин. В свою очередь, рост активности Гардошканалов обусловлен появлением в крови ЭИСМ. Из представления о том, что повышение СОЭ при беременности является отражением повышенной активности Гардош-каналов эритроцитов, вытекает, как минимум, три следствия.

Во-первых, базируясь на данных Del Carlo B etal. о том, что активность Гардош-каналов снижается под влиянием протеинкиназы С (ПКС) и возрастает под влиянием протеинкиназы А (ПКА), можно утверждать, что биологически активные вещества (БАВ), активирующие ПКС, будут снижать СОЭ, а БАВ, увеличивающие активность ПКА, будут повышать СОЭ (так как соответственно блокируются или активируются Гардош-каналы). Такое объяснение дает ключ к понимаю того, что в условиях in vitro БАВ в зависимости от их концентрации в среде либо снижает СОЭ, либо, наоборот, повышает СОЭ, так как на правленность изменения СОЭ определяется тем, какая протеинкиназа при действии исследуемого БАВ активируются — ПКА или ПКС. Например, показано, что окситоцин в низких концентрациях (10–7 МЕ/ мл), как правило, снижает СОЭ, а в высоких (10–3 МЕ/ мл) либо не изменяет СОЭ, либо даже повышает СОЭ. С этих позиций, изучение влияния БАВ на СОЭ венозной крови беременных женщин представляет собой один из методических приемов изучения механизма действия БАВ, в том числе сигнальных путей, которые активируются при его взаимодействии с рецептором.

Во-вторых, известно, что при серповидноклеточной анемии имеет место повышенная активность Гардошканалов, что приводит к потере воды и к повышению плотности эритроцитов, а блокаторы Гардош-каналов, в том числе клотримазоли сеникапок (Senicapoc) оказывают хороший лечебный эффект при данной патологии. Так как серповидноклеточная анемия, в определенной степени, имеет сходство с анемией беременных (если предположить, что в основе последней лежит избыточное повышение активности Гардош-каналов), то рискнем выдвинуть предположение о том, что лечение анемии беременных, вероятно, можно проводить с использованием клотримазола или других блокаторов Гардош-каналов, разрешенных к применению у беременных женщин. Несомненно, это предположение требует строгих доказательств.

В-третьих, вопрос о физиологическом значении повышения активности Гардош-каналов при неосложненном течении беременности требует дополнительного исследования. В то же время можно предположить, что за счет роста активности Гардошканалов создаются условия, повышающие способность гемоглобина матери отдавать кислород (так как с повышением выхода воды из эритроцитов возрастает транспорт газов) и препятствующие выходу гемоглобина из эритроцита. С этих позиций, текущее значение СОЭ отражает состояние кислородтранспортной функции эритроцитов матери, а динамика значений СОЭ может отражать эффективность терапии, направленной на снижение внутриутробной гипоксии плода. ё

Выводы

• Связывание ионов Са2+ в среде, уменьшение входа ионов Са2+ в эритроцит, либо блокирование работы Гардош-каналов эритроцитов снижает СОЭ гепаринизированнной венозной крови беременных женщин. Это свидетельствует о том, что повышение СОЭ, характерное для беременных женщин, обусловлено активацией Са-зависимых калиевых каналов (Гардош-каналов) эритроцитов
• СОЭ гепаринизированной смешанной (из сердца) крови небеременных крыс, находящихся в фазе мета эструса, не превышает 1–2 мм/час и не меняется под влиянием окситоцина (10–7–10–3 МЕ/мл), адреналина (10–6 г/мл) и ацетилхолина (10–6 г/мл), а при беременности, в отличие от человека, не возрастает и не меняется при воздействии дидрогестерона (10–6 г/мл)
• Постулируется, что при беременности у женщин функцию активатора Гардош-каналов и Са-активируемых калиевых каналов миометрия выполняет эндогенный ингибитор сократимости миоцитов матки (ЭИСМ), экспрессия генов которого возрастает под влиянием прогестерона
• Величина СОЭ венозной гепаринизированной крови беременных женщин и ее изменение под влиянием различных БАВ и воздействий, может служить важной информацией, отражающей состояние системы регуляции сократительной деятельности матки